流動相管理

純度與過濾：使用色譜純級或更高純度的試劑配制流動相，避免使用分析純?nèi)軇蚱浜械奈⒘侩s質(zhì)（如有機溶劑中的聚乙二醇、無機鐵離子等）會影響色譜柱性能。流動相需經(jīng)0.45μm或更小孔徑的濾膜過濾和超聲脫氣處理，減少灰塵、微生物等雜質(zhì)堵塞色譜柱，尤其是水溶性流動相易引起微生物生長而造成色譜柱阻塞。流動相最好是現(xiàn)配現(xiàn)用，放置時間最好不要超過2天。

pH控制：pH的流動相會破壞填料內(nèi)的共價鍵，“溶解”硅膠，使固定相流失，從而降低柱效，縮短使用壽命。以硅膠作基質(zhì)的固定相一般要求pH在2.5-7范圍內(nèi)使用，長期在pH>7或pH<2使用環(huán)境中，硅膠會逐漸溶解或者表面鍵合的官能團會逐漸流失。如果一定要用高或低pH的流動相，最好是選用相適應(yīng)的色譜填料。

緩沖鹽處理：若分析時流動相中含有緩沖液（通常為鹽溶液），沖洗時宜用水取代緩沖液與有機相混合沖洗色譜柱（20倍柱體積），再用100%有機溶劑沖洗。若直接用100%有機溶劑沖洗，可造成緩沖液沉積析出，從而損壞柱子品質(zhì)。同樣的，若流動相中加入酸、堿溶液時，也應(yīng)當先采用高比例的水（水：甲醇，10：90）沖洗20倍柱體積，防止強酸強堿溶液導(dǎo)致硅膠基質(zhì)填料的溶解。

色譜柱維護

清洗與再生：柱子使用一段時間后，總會有一些雜質(zhì)累積在柱內(nèi)，影響色譜柱的分離性能，通常表現(xiàn)為柱壓升高、基線不平、色譜雙峰、分離性能降低等。這些被污染的色譜柱經(jīng)清洗后，可恢復(fù)部分甚至大部分分離能力。以硅膠基質(zhì)色譜柱為例，使用后需經(jīng)較強的流動相沖洗。通常情況下，在使用硅膠、氧化鋁、極性鍵合相色譜柱時，每次用完后可先用二氯甲烷或正己烷等溶劑低流速長時間的沖洗；鍵合反相硅膠色譜柱、離子交換色譜柱和凝膠色譜柱可先用高比例的水（甲醇水混合溶劑）沖洗，再用100%甲醇沖洗。此外，色譜柱低流速的反相沖洗能夠有效除去堵塞在柱頭或篩板上的雜質(zhì)，以及清洗聚集在柱頭部位的較強吸附物質(zhì)。有些色譜柱在許多方法處理污染失效后，反過來使用，不僅柱壓降變小，柱效也可恢復(fù)如初，延長了色譜柱的使用時間。若上述常規(guī)清洗法無法清除污染物，則有必要采用更強的洗脫劑清洗，如反相材料的沖洗順序為：100%甲醇→100%乙腈→乙腈：異丙醇（75：25，V/V）→100%異丙醇。或者可以采用較低濃度的稀酸或稀堿可將有機溶劑不能洗脫的污染物除去。例如采用0.05mol/L的硫酸和流動相溶液沖洗色譜柱，可取得良好效果；或者采用1%氫氧化銨或50%二甲基甲酰胺水溶液，對聚集在柱頭的污染物具有良好的清洗效果。蛋白質(zhì)對反相色譜柱的污染已成為常見問題，尤其在分離未經(jīng)處理的動物組織等生物樣品。一般情況下，純有機溶劑如乙腈或甲醇不能很有效地清洗色譜柱，因而需要一些特殊的清洗方法。

保護柱使用：“保護柱”是與所使用液相色譜柱相同填料的短型色譜柱，可以有效地阻攔容易損壞色譜柱的大分子和不溶性顆粒，過濾易沉著色譜柱上產(chǎn)生死吸附的物質(zhì)，從而延長色譜柱使用壽命。

操作規(guī)范

流速與柱壓控制：粒徑為1.8μm的UPLC的流速常設(shè)為0.3-0.5mL/min，粒徑為5μm的HPLC分析流速不大于1.5mL/min，粒徑為10μm半制備柱流速控制在3mL/min。流速過大，壓力升高，會引起色譜填料沖垮、塌陷。每次開機使用分析儀器時，泵啟動太快，流速和柱壓的瞬間升高，柱床受到?jīng)_擊，引起紊亂，產(chǎn)生空隙，影響色譜柱的使用壽命。因此，在操作實驗開始時，應(yīng)當將流速和柱壓逐漸增加。

溫度控制：不同類型的色譜柱耐受的溫度各有差別。通常色譜柱溫維持在10-40℃之間，能夠充分、較優(yōu)地發(fā)揮色譜柱的性能。